Serum antibodies in coeliac disease

Abstract

Keliakian diagnostiikan kulmakivenä on ohutsuolikoepalatutkimus, jolla keliakiaan liittyvä limakalvon suolinukan tuhoutuminen havaitaan. Tuntien taudin yleisyyden, oireettomuuden ja moni-ilmeisyyden on diagnostiikassa luotettavien ja kustannuksiltaan kohtuullisten ei-invasiivisten seulontamenetelmien kehittäminen tärkeää. Retikuliini- ja endomysiumvasta-ainetestit ovat erittäin herkkiä ja tautispesifisiä ja niitä käytetään yleisesti keliakian seulonnassa ja dieettihoidon seurannassa. Määritykset tehdään seeruminäytteestä immunofluoresenssi-menetelmällä käyttäen joko rotan kudoksista (retikuliinivasta-aineet) tai apinan ruokatorvesta (endomysiumvasta-aineet) valmistettuja jääleikkeitä antigeenina. Retikuliinivasta-ainetestin heikkoutena on kuitenkin laboratoriokohtaisuus ja endomysiumvasta-ainetestissä antigeenin käytön esteeksi on muodostunut hinta ja myös eettiset kysymykset. Uusimmissa tutkimuksissa on osoitettu, että ihmisen napanuora, joka on helposti saatava ja halpa kudos, voisi korvata rotan kudosten ja apinan ruokatorven käytön kudosvasta-ainetesteissä. Retikuliini- ja endomysiumvasta-aineet ovat autovasta-aineita, ja fibroblastien on osoitettu tuottavan näihin IgA-luokan vasta-aineisiin sitoutuvia antigeenimolekyylejä. Viimeisimpien tutkimustulosten mukaan transglutaminaasientsyymi, jota esiintyy runsaasti selkärankaisten elimissä ja kudoksissa, olisi keliakian pääasiallisin autoantigeeni.

Tutkimuksessamme käytimme ihmisen napanuoraa antigeenina immunofluoresenssitestissä ja selvitimme testin käyttökelpoisuutta keliakian seulonnassa. Selvitimme soveltuvatko napanuorasta eristetyt fibroblastit ja transglutaminaasientsyymi antigeeniksi määritettäessä keliakia-spesifisiä vasta-aineita uusilla ELISA-menetelmillä. Tutkimme myös potilasseerumien tunnistamien antigeenien ja transglutaminaasin jakaumaa jyrsijöiden ja kädellisten kudoksissa kaksoisimmunofluoresenssimenetelmällä.

Tutkimuksissamme osoitimme, että ihmisen napanuora, joka on helposti saatava ja halpa kudos, voi korvata rotan kudosten ja apinan ruokatorven käytön immunofluoresenssimenetelmällä tehtävissä kudosvasta-ainetesteissä. Tuloksemme osoittivat, että napanuoran fibroblastisolut sisältävät keliakian autoantigeenejä ja soveltuvat autovasta-aineiden tutkimiseen. Kokosolu-ELISA menetelmä ei kuitenkaan ole kovin käytännöllinen tutkimustapa. Tutkimustuloksemme osoittavat myös, että meillä on nyt kliiniseen potilastyöskentelyyn soveltuva herkkä ja spesifinen ELISA-menetelmä, joka mittaa keliakiaspesifisiä

transglutaminaasivasta-aineita. Testin tulokset korreloivat hyvin retikuliini-ja endomysiumvasta-ainetestien tulosten kanssa. Lisäksi testi on helpompi suorittaa ja tulkita kuin kudosvasta-ainetestit. Tutkimuksemme vahvistaa näkemystä siitä, että transglutaminaasi on ellei ainoa niin ainakin yksi keliakian autoantigeeneistä.

In the present study human umbilical cord was used as antigen in immunofluorescence assay, and the viability of the test to detect coeliac disease was evaluated. Novel ELISA methods were established to measure coeliac disease-specific antibodies to human umbilical cord-derived fibroblasts, and to tTG. The study population included 276 patients with untreated coeliac disease, 346 controls and 14 coeliac patients with IgA-deficiency. For comparative purposes ARA and monkey oesophagus EmA were examined by immunofluorescence techniques and AGA with ELISA. To study the tissue distribution of tTG coeliac and non-coeliac patient sera, mAb-tTGs and sera from mice parenterally immunised against tTG, tTG complexed with gliadin, or gliadin were used in indirect immunofluorescence and double-staining studies. In addition, KSCN-extraction, antibody competition and affinity chromatography studies were performed to study further the relationship between tTG and tissue autoantibodies. IgA-class EmA proved highly sensitive (258 of 276) and specific (343 of 346) in detecting coeliac disease. Comparison of IgA-class EmA test to the ARA test (sensitivity 92%, specificity 94%) and to the monkey oesophagus EmA test (sensitivity 100%, specificity 83%) showed good correlation. Although the IgA-class AGA test yielded a lower sensitivity (83%) and specificity (77%) than the IgA-class EmA and ARA tests, high AGA titres were found in eight out of 12 patients negative for EmA and ARA.

The novel whole-cell fibroblast autoantibody ELISA detected all 27 coeliacs tested, giving a sensitivity of 100%; with a specificity of 82% (54 of 66). The test correlated better with the EmA than with the AGA test. The calcium-treated tTG antibody ELISA proved to be highly sensitive, 129 of 136 (95%) tested untreated coeliac disease patients were positive. Thirteen out of 207 disease control patients had elevated titres (specificity 94%). The concordance rate between the IgA-class tTG antibody ELISA and IgA-class EmA tests was high (93%). The predictive ability of the new tTG antibody ELISA test was superior to that of the AGA test.

In selective IgA deficiency the IgG-class EmA and tTG autoantibody tests seem to work well. All 14 untreated coeliac patients with selective IgA deficiency were positive for these autoantibodies.

The tTG antibody staining patterns here were seen to be identical to those with coeliac patient sera in all tissues studied. Cultured human umbilical cord-derived fibroblasts exhibited both cytoplasmic and extracellular matrix staining. Double staining with coeliac patient serum IgA and mAb-tTG showed complete overlapping. KSCN-extraction of tTG from the tissue sections abolished the staining patterns, and they were restored after re-addition of tTG. Patient sera blocked the staining of mAb-tTG, and tTG effectively absorbed EmA/ARA from coeliac patient sera.

I conclude that coeliac disease self-epitopes are present in the human umbilical cord, and this tissue replaces perfectly rat and monkey tissues when using the indirect immunofluorescent test for detecting coeliac disease-specific autoantibodies. The present study shows that coeliac disease self-epitopes are present also in human umbilical cord and that the Wharton s jelly-derived fibroblasts indeed express molecules detectable by coeliac disease patient sera IgA. These fibroblasts could be used as antigen in the novel whole-cell ELISA test. Further, the findings here constitute evidence of the value of a combined search for IgA-class EmA, ARA and high-titre AGA.

The present data further confirm that tTG is a major autoantigen in coeliac disease. In clinical practice the ELISA designed for the detection of tTG antibodies provides an alternative possibility for a sensitive, specific and objective serological screening for the diagnosis and follow-up of coeliac disease. It was also established that tTG is distributed in both rodent and primate tissues identically to the extracellular endomysial/reticulin/jejunal staining pattern of coeliac patient sera. The current results indicate that EmA, ARA and jejunal autoantibodies detect tTG in different tissues.