Calcitonin Gene-Related Peptide. Characterization of Binding Sites and Structure-Activity Relationships in the Eye and Effects on Intraocular Pressure

Abstract

Glaukooma on krooninen, asteittain etenevä näköhermon sairaus, jonka tärkein riskitekijä on korkea silmänpaine. CGRP on 37:stä aminohaposta koostuva peptidi, jota esiintyy tunto- ja liikehermoissa sekä keskus- että ääreishermostossa. Sillä on monia tehtäviä, mutta ehkä parhaiten se tunnetaan verisuonia voimakkaasti laajentavana yhdisteenä. Silmässä sitä on löydetty esim. sarveiskalvosta, sädekehästä, värikalvon verisuonista, kammiokulman trabekkelikudoksesta ja suonikalvosta. Silmän etukammioon annettuna sen on havaittu alentavan silmänpainetta kissan silmässä lisäämällä kammionesteen ulosvirtausta, kun taas kanin silmässä sen on havaittu helposti nostavan silmänpainetta rikkomalla veri-kammioneste-esteen silmässä.

Tutkimuksessa todettiin, että CGRP vaikuttaa merkittävästi silmän kammionesteen dynamiikkaan vaikuttamalla ainakin kammionesteen ulosvirtaukseen. CGRP:n havaittiin kanilla aiheuttavan lasiaiseen annosteltuna pitkittyneen silmänpaineen laskun ja lisäävän sekä silmän etukammioon että lasiaiseen annettuna kammionesteen poistumista. Prostaglandiini F2a:n kanssa yhdessä annettuna niiden yhteisvaikutus ei merkittävästi lisännyt CGRP:n itsensä aiheuttamaa vaikutusta. Spesifisiä sitoutumiskohtia löydettiin kissan kammiokulman alueen lisäksi apinan, sian, kissan ja marsun silmän eri kudoksista ja ne saattavat merkitä sillä olevan myös muita tehtäviä silmässä. Rakenteeltaan CGRP:tä lähellä olevat amyliinit pystyivät myös syrjäyttämään CGRP:n spesifistä sitoutumista, osoittaen niiden pystyvän sitoutumaan CGRP:n kanssa samoihin reseptoreihin silmässä. CGRP:n rakennetutkimuksessa ilmeni lisäksi erityisesti molekyylin alkupäässä tehtävien muutosten vaikuttavan peptidin aktiivisuuteen ja loppupäässä tehtävien muutosten vaikuttavan reseptorisitoutumiseen.

CGRP -molekyylin iso koko estää sen imeytymisen silmän sisään suoraan silmän pinnalta. Sen kammionesteen ulosvirtausta lisäävä vaikutus tekee siitä kuitenkin mielenkiintoisen yhdisteen glaukooman hoidon kannalta. Peptidin toiminnalle oleellisten aminohappojen ja kolmiulotteisen rakenteen vielä tarkempi kartoittaminen tulevaisuudessa parantaa mahdollisuuksia kehittää silmänpainetaudin hoitoon CGRP:stä lyhyempi, helpommin silmän sisään imeytyvä peptidi, tai jokin muu samat ominaisuudet omaava yhdiste.

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) is a 37-amino acid peptide existing in a and b forms. It is widely distributed in the central and peripheral nervous systems. CGRP has several functions in the tissues but is probably best known as a potent vasodilator. In the eye, CGRP-immunoreactive nerves have been found in several tissues, including cornea, ciliary body, iris blood vessels, trabecular meshwork and choroid. In the rabbit eye it has been reported to induce vasodilatation and further, to disrupt the blood-aqueous barrier (BAB), leading to an increase in intraocular pressure (IOP). In contrast, in the cat eye CGRP has been reported to reduce IOP probably by increasing the conventional outflow of aqueous humour.

In the present study, CGRP binding sites in the eye were localized and further characterized using different forms of CGRP fragments, analogs and amylins. The structure-activity relationship of CGRP has been investigated by receptor binding and measurement of adenylate cyclase enzyme activity. To evaluate the effect of CGRP on the aqueous humour dynamics in the rabbit eye, manometrical measurement of IOP and the two-level constant pressure infusion method were used in the presence and absence of PGF2a.

CGRP binding sites were found in the ciliary muscle, ciliary processes and limbal conjunctiva of the monkey, pig, cat and guinea pig, in the iris of the pig, cat and guinea pig, in the chamber angle in the cat, in the choroid of the monkey, pig and guinea pig and in the retina of the pig. Specific CGRP binding in the anterior part of the monkey, feline and porcine eye was displaced by cat, human and rat amylins. This effect was greatest in feline and porcine eyes, where 125I-CGRP was displaced from different anterior tissues by all three amylins. The carboxyterminal end of the CGRP peptide was found to be responsible for the binding, while the aminoterminal end of the peptide was responsible for adenylate cyclase (AC) enzyme activation. The temperature-dependent conformation of the peptide structure seems to play a role in the affinity of the CGRP to its receptors. In addition to the known effects of CGRP in the eye, e.g. vasodilatation and breakdown of the BAB, CGRP induced a prolonged IOP decrease after intravitreal administration in the rabbit and increased the outflow facility after both intracameral and intravitreal administration. PGF2a had no clear additive effect on the increased outflow facility induced by CGRP.

It is concluded that CGRP has a marked effect on the aqueous humour dynamics in the eye by affecting at least the aqueous humour outflow. The specific binding sites found in other ocular tissues indicate that CGRP may also have other functions in the eye. Although the CGRP receptor has a complex structure and function, structure-activity studies with the peptide provide information on the essential parts of the CGRP molecule important for further development of active compounds mimicking or modulating the effects of this potent peptide.