Post-translational modifications in regulation of JAK-STAT pathway

Abstract

Sytokiinit säätelevät hematopoieettisten solujen kasvua ja erilaistumista JAK-STAT signalointireittien kautta. Sytokiinin sitoutuminen solukalvon läpäisevään reseptoriin laukaisee solunsisäisen JAK-tyrosiinikinaasin aktivaation. Aktivoitu JAK-kinaasi fosforyloi reseptorin solunsisäisen osan tyrosiinitähteen, joka toimii solunsisäisen STAT (signal transducer and activator of transcription)-transkriptiotekijän sitoutumiskohtana. STAT-proteiinin aktivaatio puolestaan tapahtuu JAK-välitteisen fosforylaation avulla. JAK-kinaasit fosforyloivat STAT-proteiinin C-terminaalisen tyrosiinitähteen aiheuttaen STAT-dimeerien muodostumisen ja muodostuneen dimeerin siirtymisen sytoplasmasta solun tumaan, jossa STAT säätelee kohdegeenien transkriptiota. JAK- ja STAT-proteiinien aktivaation, toiminnan ja lokalisaation säätelyyn osallistuu myös säätelyproteiineja, kuten SOCS- (suppressors of cytokine signaling), PIAS- (protein inhibitors of activated STAT) ja PTP- (protein tyrosine phosphatases) proteiinit. Solun sisäisten proteiinien, kuten JAK ja STAT säätelyssä translaation jälkeinen muokkaus on keskeisessä asemassa. Useat proteiinit hajoitetaan substraattispesifisen ubikitiini-proteosomi reitin kautta. Substraattiproteiinit tunnistetaan niihin liitettyjen ubikitiini-molekyylien avulla ja ne ohjataan proteosomeihin, joissa tapahtuu kohdeproteiinin hajoitus. Vaikka proteiinien sumolaation mekanismi on samankaltainen kuin ubikitinaation, sumolaatio ei johda proteiinihajoitukseen. Sen sijaan monet solunsisäiset prosessit, kuten DNA:n replikaatio, transkription aktivaatio, tumakuljetus ja signaalinvälitys ovat sumolaation säätelemiä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää JAK-STAT signalointireitin säätelymekanismeja. JAK2-kinaasin aktiivisuutta säädellään ubikitinaation kautta ja JAK2-proteiinin tyrosiinifosforylaatio on edellytys polyubikitiiniketjun muodostukselle ja proteosomaaliselle hajoitukselle. Koska SOCS1 sitoutuu ubikitiinireitin E3-ligaasi proteiinikompleksiin kuuluvaan Elongin B/C-proteiiniin, halusimme tutkia SOCS-proteiinien vaikutusta JAK2-proteiinin aktiivisuuden säätelyssä. SOCS1, toisin kuin SOCS3, lisäsi aktiivisen JAK2-proteiinin hajoitusta ja SOCS1-proteiinin vaikutus oli SOCS-box-domeeniriippuvainen. Nämä havainnot osoittivat, että JAK2-proteiinin ubikitinaatio on sytokiinisignaloinnin fysiologinen säätelymekanismi, joka toimii solujen tasapainon säätelyssä JAK2 yliaktivaatiossa.

Koska STAT1-proteiini sitoutuu SUMO E3-ligaasi PIAS1:n, halusimme tutkia onko STAT1 sumolaation kohdeproteiini. STAT1:n TAD (transactivatio domain)-domeenin sumoloitui lysiini- aminohappoon kohdassa 703 ja PIAS proteiinit toimivat E3-ligaaseina. PIAS-proteiinien toiminta STAT1 sumolaatiossa oli riippuvainen PIAS:ien RING finger-like- domeenista. Sumolaation vaikutus STAT1-välitteisen transkription aktivaatioon oli negatiivinen. STAT1:n sumolaation vaikutus STAT1 kohdegeenien aktivaatioon oli selektiivinen ja sumolaatio vähensi geeniaktiivisuutta niillä STAT1:n kohdegeeneillä, joissa STAT1:lla on heikko affiniteetti promoottoriin. STAT1-mutantti, jossa sumolaatiokohta on poistettu, sitoutui DNA-kohdesekvenssiin voimakkaammin kuin STAT1 villityyppi. STAT1-mutantti myös vaikutti tyrosiinifosforyloidun STAT1:n paikallistumiseen tumassa siten, että se säilyi tumassa pidempään kuin villityyppi. SUMO-spesifisen proteaasin, SENP1:n havaittiin toimivan proteaasina myös STAT1:n sumolaatiossa ja sumolaation poistaminen SENP1:n avulla korreloi STAT1:n lisääntyneeseen transkription aktiivisuuteen.

Tässä tutkimuksessa olemme esittäneet kaksi aiemmin karakterisoimatonta JAK-STAT signalointireitin säätelymekanismia, jotka toimivat sytokiinivasteiden molekulaaristen mekanismien hienosäätelijöinä.

Cytokines regulate the growth and differentiation of hematopoietic cells through activation of the JAK-STAT signaling pathway. Ligand binding to specific cell-surface receptor results in activation of the receptor-associated JAK tyrosine kinases. Activated JAKs phosphorylate specific tyrosine residues on the receptor cytoplasmic tail providing docking sites for the latent cytoplasmic STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors. STATs are activated through JAK-mediated phosphorylation of a single C-terminal tyrosine residue causing their dimerization and translocation to the nucleus and finally modulation of transcription of their specific target genes. Regulation of the activity, function and localization of JAKs and STATs involves interaction with regulatory proteins such as SOCS (suppressors of cytokine signaling), PIAS (protein inhibitors of activated STAT) and PTPs (protein tyrosine phosphatases), as well as various other post-translational modifications. Post-translational modifications are a central mechanism to regulate the functions of cellular proteins. The ubiquitin-proteasome pathway degrades a wide range of protein substrates with high specificity through two discrete and successive steps: firstly, substrate recognition involving the ubiquitin conjugation cascade, and secondly the degradation process mediated by the proteasomes. Sumoylation of target proteins involves a reaction mechanistically similar to ubiquitination. However, sumoylation does not lead to protein degradation, but is involved in regulation of many cellular processes such as DNA replication and repair, transcription activation, nuclear transport and signal transduction.

The aim of this study was to investigate the regulatory mechanisms of JAK-STAT pathway. Ubiquitination was found to regulate JAK2 activation in vivo and in vitro, and tyrosine phosphorylation was a requirement for efficient polyubiquitination and proteasomal degradation of JAK2. The interaction between SOCS1 and Elongins B/C, which were implicated in the ubiquitination reaction, led us to investigate the role of SOCS proteins in the regulation of JAK2 protein turnover. SOCS1 but not SOCS3 enhanced the degradation of activated JAK2 in a SOCS-box dependent manner. These studies identified ubiquitination of JAK2 as a physiological regulatory mechanism in cytokine signaling, that appears to function as a final fail-proof mechanism to maintain cellular homeostasis in case of hyperactivation of JAK2.

The interaction between STAT1 and SUMO E3 ligase PIAS1 led us to investigate if STAT1 was subject to sumoylation. STAT1 was found to be a substrate for SUMO-1 conjugation at a single Lys703 residue in the conserved TAD domain (transactivation domain) in IFN-g signaling. PIAS proteins were shown to act as SUMO E3 ligases and enhance the sumoylation of STAT1 and this function was dependent on the PIAS RING finger-like domain. Sumoylation had a negative regulatory role in STAT1-mediated transcription activation, and selectively inhibited the induction of genes with weak affinity promoter to STAT1. Sumoylation defective STAT1 mutant showed a prolonged DNA-binding activity and nuclear localization in response to IFN-g stimulation. Removal of conjugated SUMO-1 from STAT1 was found to be mediated by SUMO-specific protease SENP1. De-conjugation of SUMO-1 correlated with increased STAT1-mediated transcription activation, confirming the negative regulatory role of sumoylation in STAT1 -dependent transcription.

The results from the current work have identified two previously uncharacterized mechanisms for regulation of JAK-STAT signaling, which provide new insights into the molecular mechanisms involved in modulation and fine-tuning of cytokine responses.