Chlorambucil-Induced Toxicity, Mutagenicity and Gene Expression Alterations in Normal and DNA Repair-Deficient Escherichia Coli Strains

Abstract

Syöpälääkkeitä ryhdyttiin määrätietoisesti kehittämään 1950-luvun aikana. Yksi ensimmäisistä potilaille käytetyistä lääkkeistä oli klorambusiili, joka tuli klinikkaan vuonna 1961. Tätä ennen oli todettu, että lääke pienensi kokeellista kasvainta noin puolella kymmenestä koe-eläimestä. Klorambusiili vakiinnutti pian asemansa eräiden kasvaintyyppien (lymfooma ja krooninen lymfaattinen leukemia) käypänä hoitona. Tämä merkitsi sitä, että laajoja tutkimuksia ­ toisin kuin nykyään ­ ei lääkkeen vaikutusmekanismeista tarvinnut tehdä. Sen verran tiedettiin, että klorambusiili vaurioittaa solujen DNA:ta ja saa aikaan solujen kuoleman. Ongelmana oli ja on edelleenkin se, että myös normaalit kudokset kärsivät hoidoista ja toisaalta syöpäsolut vähitellen oppivat sietämään lääkettä. Tämä saattoi johtua siitä, että syöpäsolut oppivat mutatoitumalla vahvistamaan niitä mekanismeja, joiden avulla solut luonnollisestikin korjaavat vastaavia vaurioita. Tutkimuksessa keskityttiin erityisesti DNA-vaurioihin ja niiden korjaantumiseen.

Tutkimusta varten valittiin mahdollisimman yksinkertaiset solumallit, joista oli geeniteknologian keinoin poistettu niitä geenejä (ja vastaavia entsyymeitä), joiden arveltiin olevan vastuussa klorambusiilin aiheuttamien DNA-vaurioiden korjaantumisesta. Tällaisen mallin tarjosivat kolibakteerit: kolme DNA-korjauksen suhteen vajavaista Escherichia coli -kantaa ja yksi normaali vertailukanta. Tutkittavat kolibakteerikannat käsiteltiin klorambusiilillä. Käsittelyn jälkeen tutkittiin kolmea pääasiaa. Ensiksi, suojaako tehokas DNA-korjaus soluja kuolemalta. Toiseksi, eroavatko kannat klorambusiilin aiheuttamien mutaatioiden suhteen. Ja kolmanneksi, mitä klorambusiili vaikuttaa eri kantojen geenien aktiivisuuteen eli luentaan. Työssä tutkittiin klorambusiilin vaikutusta jokaiseen E. colin 4290:een geeniin. Tämän mahdollisti uusimpien DNA-tekniikoiden (ns. geenisirut) käyttö.

Tutkimuksen tulokset olivat sangen selväpiirteisiä, uusia ja osin täysin odottamattomia. Odotettua oli, että solut kärsivät enemmän, jos niiltä oli poistettu jokin tärkeistä DNA:n korjausmekanismeista. Tulokset vaihtelivat riippuen siitä, mikä korjausmekanismi oli poistettu (suora korjaus, emäseksisiokorjaus, mismatch-korjaus). Normaalit geenit vertailukannassa suojasivat soluja sekä kuolemalta että mutatoitumiselta. Löydös on tulkittavissa siten, että mahdollisesti ihmisen syöpäsolujen resistenssi klorambusiilille voisi johtua DNA-korjauksen tehostumisesta. Klorambusiili vaikutti sangen eri tavoin eri kolikantojen geenien luentaan. Tämä oli odottamaton löydös, koska vain yksi geeni 4290:n joukosta oli poistettu. Emäseksisiokorjauksen suhteen puutteellinen solukanta yllättäen aktivoi useita itsetuhoisia geenejä ja toisaalta esti normaalisti suojaavien geenien toimintaa. Tämä voidaan tulkita solubiologisesti mielekkääksi ilmiöksi: mieluummin kuolema kuin mutatoituminen. Tulokset luovat uutta pohjaa sille, miten varsinaisia ihmisen syöpäsoluja ja syöpälääkeresistenssiä voitaisiin jatkossa tutkia.

Chlorambucil (CLB; N,N-bis(2-chloroethyl)-p-aminophenylbutyric acid) is a bifunctional alkylating agent. This nitrogen mustard was among the first drugs employed in the treatment of cancer. The use of DNA-damaging agents, such as CLB, remains one of the primary regimes in cancer chemotherapy. The utility of such agents is often compromised by the emergence of drug resistant tumour cells. The purpose of the present study was to investigate whether the lack of certain DNA repair mechanisms might affect the CLB-induced toxicity, mutagenicity and the gene expression in genetically engineered Escherichia coli (E. coli) strains.

E. coli is a widely used model in biochemical genetics, molecular biology and biotechnology. The E. coli genome is very simple in comparison to the human genome. In this work, a total of four strains were used: (i) the wild-type strain AB1157 K-12 (WT), (ii) the LR39 strain lacking the ada, ogt genes, (iii) the MV1932 strain lacking the alkA1, tag-1 genes, and (iv) the GM5555 strain lacking the mutS gene. The LR39 strain is deficient in DNA repair by direct reversal of damage. The lacking genes ada and ogt encode the O6-methylguanine-DNA methyltransferase I and II, respectively. The MV1932 strain is deficient in base excision repair (BER). The lacking genes in this strain, alkA1 and tag-1, encode the 3-methyladenine DNA glycosylase II and I, respectively. The GM5555 strain is deficient in methyl-directed mismatch repair (MMR). The missing gene mutS encodes for the MutS protein.

The cells were exposed to CLB in suspension cultures. Since E. coli cell wall is not naturally permeable to CLB, the cells had first to be treated with polymyxin B nonapeptide(PMBN) to make them permeable to CLB. The toxicity of CLB, its major catabolic product phenylacetic acid mustard (PAM; 2-(4-(bis(2-chloroethyl)amino)phenyl)acetic acid) and some reference compounds was measured in suspension cultures and by assessing the plating efficiency of the E. coli cells in agar cultures. The mutagenicity of the compounds was quantified by development of agar plate colonies resistant to indicator antibiotics rifampicin(rif) or ciproxin (cip). Global genomic expression was investigated by using nylon membrane DNA arrays representing all E. coli genes. The level of gene expression was measured by autoradiography of the radioactive (33P) cDNA hybridized arrays.

The results showed that in all three DNA repair-deficient E. coli strains, CLB was both toxic and mutagenic. In the BER and MMR deficient strains, CLB was clearly more toxic and mutagenic than in the DNA repair-proficient wild-type strain. For the strain deficient in repair by direct reversal of damage, the results were closer to the WT strain. The lack of BER rendered the cells very susceptible to both the toxic and mutagenic effect of CLB. The lack of MMR resulted in a high mutagenicity in the cells after CLB-treatment. The results implicate that all these three DNA repair mechanisms are involved in the survival of the cells after CLB-treatment and in the prevention of mutagenesis. On the basis of these results, it is very likely that modulation of DNA repair capacity may improve the usefulness of alkylating drugs such as CLB and PAM.

The global gene expression in the four strains was very similar. The natural exception was the lack of expression of the specific knock-out genes. This indicates that these repair genes are not necessary under optimal growth conditions.

CLB caused different gene expression changes in different E. coli strains. In WT cells two mechanisms that can prevent toxic and mutagenic CLB damages were upregulated: a transport protein that might be involved in drug efflux and thioredoxin that is involved in preventing oxidative stress and in DNA synthesis. In the BER-deficient strain, a suicidal gene expression alteration was observed. Many important genes for preventing the harmful toxic and mutagenic effects of CLB were downregulated. These included a SOS response gene, a cross-linking resistance gene and certain genes involved in DNA repair. This finding is very surprising, since it has generally been accepted that the DNA damage itself is directly responsible for the harmful outcome of the genotoxic treatment.

There were similarities in the responses to CLB in the strains deficient in direct reversal of damage or in mismatch repair. In these two strains, SOS response genes, oxidative stress preventing genes and multidrug efflux protein genes were upregulated to protect the cells from CLB-induced toxic and mutagenic effects. These results demonstrated that the gene expression may change to either protect the cells or kill them.